WB實(shí)驗(yàn)服務(wù)簡介

Western Blot（簡稱WB）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測特定蛋白質(zhì)在復(fù)雜樣品中的存在和相對豐度。該技術(shù)結(jié)合了聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移和免疫檢測三個主要步驟。通過SDS-PAGE將蛋白質(zhì)根據(jù)分子量分離，然后將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，接著使用特異性抗體進(jìn)行檢測，通過二抗放大信號，并通過化學(xué)發(fā)光或熒光檢測來顯示蛋白質(zhì)的存在和數(shù)量。

WB實(shí)驗(yàn)服務(wù)的基本步驟

  1.樣品準(zhǔn)備：使用適當(dāng)?shù)牧呀庖禾崛〉鞍踪|(zhì)，并進(jìn)行蛋白定量，確保每個樣品含有相同量的總蛋白。

  2.凝膠電泳：制備SDS-PAGE凝膠，根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小選擇合適的凝膠濃度，進(jìn)行電泳分離蛋白質(zhì)。

  3.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移：將分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，常用的膜材料有硝酸纖維素膜和PVDF膜。

  4.封閉非特異性位點(diǎn)：使用含有BSA或脫脂奶粉的緩沖液封閉膜，以減少非特異性抗體結(jié)合。

  5.免疫檢測：一抗孵育后，通過洗滌去除未結(jié)合的一抗，然后進(jìn)行二抗孵育，二抗通常帶有酶標(biāo)記，如辣根過氧化物酶（HRP）。

  6.信號檢測：使用化學(xué)發(fā)光底物或熒光底物進(jìn)行信號檢測，通過X光膠片或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)捕捉信號。

  7.數(shù)據(jù)分析：通過分析條帶的強(qiáng)度，可以定量分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

實(shí)驗(yàn)技巧和注意事項(xiàng)

  1.在整個過程中保持低溫，以減少蛋白質(zhì)變性和降解。

  2.在進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)移和免疫檢測時，要確保使用正確的緩沖液。

  3.在進(jìn)行轉(zhuǎn)移和免疫檢測時，要控制好時間和溫度，以避免過度或不足的反應(yīng)。

  4.所有的操作都應(yīng)在干凈的環(huán)境中進(jìn)行，以避免污染。

常見問題和解決策略

  1.無條帶或條帶弱可能是由于抗體濃度不夠、樣本中蛋白含量低、轉(zhuǎn)膜失敗或抗體活性降低等原因造成的。解決辦法包括增加抗體濃度、提高蛋白上樣量、優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件或更換新鮮抗體。

  2.多條帶或高背景可能是由于一抗或二抗的非特異結(jié)合、蛋白降解或試劑污染等原因造成的。解決辦法包括降低抗體濃度、使用特異性更高的抗體、增加洗滌次數(shù)或更換試劑。

在進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)時，應(yīng)仔細(xì)遵循實(shí)驗(yàn)步驟，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整條件以獲得最佳的實(shí)驗(yàn)效果。同時，應(yīng)注意實(shí)驗(yàn)材料的新鮮性和實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。