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克隆形成實(shí)驗(yàn)

簡要描述：克隆形成實(shí)驗(yàn)是測定細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。細(xì)胞克隆形成率表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量，可以反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。

更新時(shí)間：2022-12-23
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實(shí)驗(yàn)步驟

1.取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的細(xì)胞生長培養(yǎng)基中備用。

2.將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細(xì)胞每皿分別接種100個(gè)細(xì)胞于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。

3.置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。

4.當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。

6.去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘

7.用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

8.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。后計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%

9.平板克隆形成試驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。

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